如何防止聚丙烯酰胺垂直電泳漏膠現象已成爲實驗室研究人員比較頭疼的問題！

 1. 固定玻璃闆時，先将厚薄玻璃闆在桌面對(duì)齊後在垂直面上稍微向厚闆傾斜20度，使底面薄闆略高於(yú)厚闆。

 2. 将固定好的玻闆固定於(yú)放有海綿墊的制膠架上，固定時用手稍用力往下壓，此時封閉的灌膠系統準備(bèi)完畢。

 3. 除瞭(le)以上安裝技巧外，由於(yú)海綿橡膠墊用久後會老化或者損壞，從而導緻漏膠的現象時常發生，建議用戶可以購買粘性高柔軟性好的橡膠墊。

常見問題及分析 

1. 配膠緩沖液系統對電泳的影響？

 在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介於二者之間泳動。由於導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成瞭(le)較高的電壓梯度，壓著(zhe)蛋白質分子聚集到一起，濃縮爲一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠後，由於膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊随氯離子之後，同時由於分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以
，pH對(duì)整個反應體系的影響是重要的，實驗中在排除其他因素之後仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該(gāi)因素
。

 2. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與爲蛋白質電(diàn)泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電(diàn)泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關(guān)；

 制膠緩沖(chōng)液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質電(diàn)荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折疊。

 3.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由於(yú)凝膠的中間(jiān)部分凝固不均勻所緻，多出現於(yú)較厚的凝膠中。

 處(chù)理辦(bàn)法：待其充分凝固再作後續實驗
。

 4. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現在蛋白質垂直電(diàn)泳槽中，一般是兩闆之間的底部間隙氣泡未排除幹(gàn)淨。

 處理辦(bàn)法：可在兩闆間加入适量緩沖(chōng)液，以排除氣泡。

 5. 爲什麽帶出現拖尾現象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠(jiāo)濃度過(guò)大引起的。

 處理辦(bàn)法：加樣前離心；選擇适當的樣品緩沖液，加适量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。

 6. 爲什麽帶出現紋理現象？

 主要是樣(yàng)品不溶性顆(kē)粒引起的。

 處(chù)理辦(bàn)法：加樣前離心；加适量樣品促溶劑。

7. 什麽是“鬼帶”，如何處理？

 “鬼帶(dài)”就是在跑大分子構象複雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶(dài)或加樣孔底部有沉澱，主要由於(yú)還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，緻使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合
，聚合成大分子，其分子量要比目标條帶(dài)大，有時不能進入分離膠。但它卻於(yú)目标條帶(dài)有相同的活性，在WB反應中可見其能與目标條帶(dài)對應的抗體作用。

 處理辦(bàn)法：在加熱煮沸後，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加适量EDTA來阻止還原劑的氧化。

 8. 爲什麽溴酚藍不能起到指示作用？

 我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出闆底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖(chōng)液和分離膠的濃度有關(guān)。

 處理辦(bàn)法：更換正確(què)pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

9. 爲什麽電泳的條帶很粗？

 電(diàn)泳中條帶(dài)很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

 處理辦(bàn)法：适當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(què)（6.7）；适當降低電壓；

 10. 爲什麽電泳電壓很高而電流卻很低呢？

 這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由於(yú)電泳槽沒有正確(què)裝配，電流未形成通路。包括：a.内外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

 處理辦(bàn)法：電泳槽正確(què)裝配即可。 

11. 濃縮膠與分離膠斷裂、闆間有氣泡對電泳有影響嗎？ 

這主要出現在初學者中，一般對電(diàn)泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所緻；後者是由於(yú)在解除制膠的夾子後，闆未壓緊而緻空氣進入引起的。

12. 凝膠時間不對，或慢或快，怎麽回事？

 通常膠在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應該(gāi)現配現用，TEMED不穩定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電(diàn)泳時易燒膠。 

13. 電泳時間比正常要長？

 可能由於(yú)凝膠緩沖(chōng)系統和電級緩沖(chōng)系統地PH選擇錯誤，即緩沖(chōng)系統地PH和被分離物質的等電點差别太小，或緩沖(chōng)系統的離子強度太高。

 14.分離膠加上後爲什麽要立即加水？

 加入分離膠後，立即覆一層(céng)雙蒸水，一是爲瞭(le)使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

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